واکنش زنجیره پلیمراز معکوس (RT-PCR)

واکنش زنجیره پلیمراز معکوس (RT-PCR)

آزمایش RT-PCR (واکنش زنجیره پلیمراز معکوس) برای کادر درمان و افرادیست که به بیمارستان مراجعه کرده‌اند و علائم کرونا دارند، انجام داده می‌شود. ازین رو قسمت مهم اینجاست که بفهمیم چطور ارزش اخباری این نوع آزمایش از ابتدای قرار گرفتن در معرض بیماری و بروز علائم قابل تغییر است. اهمیت این موضوع زمانی مشخص می‌شود که نتایج آزمایش در تصمیم‌گیری تجهیزات حفاظتی که در اختیار پرسنل درمانی مورد استفاده قرار گرفته باشد.

آزمایش RT-PCR

حساسیت و اختصاصیت آزمایشاتی که بر اساس PCR برای SARS-COV-۲ انجام می‌شوند به ندرت تعیین شده است. همچنین تاثیر وجود «دوره پنجره» (Window period) بعد از ابتلا به ویروس، که به احتمال زیاد باعث منفی شدن کاذب نتیجه شده، چندان قابل شناسایی نیست. استفاده درست از ابزارهای محافظتی در بخش مراقبتی، در انجام درست آزمایش SARS-COV-۲ اهمیت بسیار زیادی دارد. به دلیل اینکه با این کار از انتقال بیمارستانی و فردی عفونت جلوگیری می‌شود. ولی هنوز بسیاری از بیمارستان ها و مراکز درمانی با کمبود تجهیزات و نیروی کار مواجه هستند.

با همه‌گیری کرونا، بیمارستان‌ها و مراکز درمانی با این مشکل روبه‌رو شدند که چگونه با افرادی که آزمایش آنها مثبت بوده چه نوع برخوردی بکنند. بر اساس خط مشی ارائه شده توسط مرکز پیشگیری و کنترل بیماری‌ها، فردی که بیماری آن اثبات شده با دو هفته در قرنطینه بماند تا احتمال سرایت به دیگرانم به حداقل برسد. برای رعایت این اقدامات نیاز به منابع است که بسیاری از بیمارستان‎‌ها این منابع را نداشته و راه دشواری پیش رو دارند. با افزایش دسترسی به آزمایش مبتنی بر RT-PCR، میزان استفاده از آن برای رد وجود عفونت در کادر درمانی هم بالا رفته است. این اقدام به منظور حفظ نیروی کار ارزشمند و تجهیزات حفاظتی کمیاب انجام می‌شود. وقتی تست کادر درمان منفی باشد، اجازه بازگشت به محل کار صادر می‌شود.

افرادی که تست PCR آنها منفی شده محدودیت‌ها بر آنان برداشته می‌شود. به این نکته توجه کنید: زمانی که تست PCR پنجره ای است، نتیجه تست منفیست ولی فرد ناقل بیماری تلقی می‌شود. بسیار مهم است که بدانیم ارزش اخباری آزمایش RT-PCR چگونه با سپری شدن زمان از اولین مواجهه و پیدایش علایم تحت تاثیر قرار می‌گیرد. این موضوع باعث جلوگیری از اطمینان کاذب از منفی بودن نتایج آزمایشات انجام شده در مراحل اولیه‌ی عفونت می‌شود. هدف مطالعه‌ی ما، تخمین میزان نتایج کاذب منفی در روزهای پس از مواجهه می‌باشد.

کاذب بودن نتیجه‌ی آزمایش PCR

۴ روز قبل از آغاز علایم (روز ۵)، احتمال منفی کاذب بودن نتیجه در یک فرد آلوده از ۱۰۰ درصد (۹۵% Cl, 100% – 100%) در روز اول به ۶۷ درصد (Cl, 27%-94%) در روز چهارم کم‌کم پایین می‌آید؛ با این وجود هیچگونه قطعیتی در این نتایج نیست. زمانی که علائم ظاهر می‌شود، به طور میانگین نتایج منفی کاذب حدود ۳۸ درصد (Cl, 18%-65%) بود (شکل ۲، بالا). این میزان در روز ۸ ام (سه روز پس از آغاز علائم) به ۲۰ درصد (Cl, 12%-30%) کاهش یافت و پس از آن مجددا و  تدریج افزایش یافته و از ۲۱ درصد (Cl, 13%-31%) در روز ۹ام به ۶۶ درصد (Cl, 54%-77%) در روز ۲۱ام  رسید.

احتمال وجود عفونت پس از منفی بودن نتیجه ی RT–PCR(که با ۱ منهای NPV به دست می‌آید) نکته: NPV همان ارزش اخباری منفی است. زمان تبدیل این نتایج به اندازه احتمال وجود عفونت بعد از آزمایش، یک نتیجه‌ی منفی در روز ۳ام، تخمین ما از احتمال نسبی عفونی بودن بیمار را فقط ۳ درصد (Cl, 0%-47%) کاهش می‌دهد (بعنوان مثال احتمال نسبی عفونی بودن فرد مورد مطالعه، از ۱۱.۲ درصد، که در یک مطالعه‌ی بزرگ بر روی موارد خانگی محاسبه شده است، به ۱۰.۹ درصد کاهش می‌یابد؛ شکل ۲ ،پایین). آزمایشات انجام شده در روز اول بروز علائم مفیدتر هستند چرا که در آن‌ها احتمال نسبی عفونی بودن بیمار به میزان ۶۰ درصد کاهش می‌یابد (Cl, 33%-80%).

احتمال عفونی بودن پس از آزمایش در بیماری که نتیجه‌ی RT-PCR وی منفی بوده است بسته به احتمال عفونی بودن قبل از آزمایش تغییر می‌کند (این موضوع، احتمال عفونت بر اساس شدت مواجهه با علایم بالینی را توصیف می‌کند).با فرض احتمال بالای عفونی بودن قبل از آزمایش (که ۴ برابر بیشتر از میزان مشاهده شده در یک مطالعه‌ی کوهورت بود)، احتمال عفونی بودن پس از آزمایش و ۸ روز پس از مواجهه، حداقل ۱۴ درصد (Cl, 9%-20%) بود (شکل ۳). با فرض اینکه احتمال عفونت پیش از آزمایش، ۵.۵ ‌درصد باشد (یعنی نصف میزان مشاهده شده در مطالعه‌ی کوهورت)، احتمال عدم عفونت در روز ۸ پس از آزمایش، هنوز هم در حالت کمینه‌ی خود قرار داشت (۱.۲%[Cl, 0.7%-2.0%]).

نتایج به دست آمده

در زمان شروع علایم، میانگین نتایج منفی کاذبی که به دست آمد، 38% بوده که این اندازه از روز هشتم به بعد تا 20% کاهش پیدا کرد و دوباره بالا رفت. به طوری که از ۲۱ درصد در روز ۹ ام به ۶۶ درصد در روز ۲۱ ام رسید. بهترین زمان برای انجام آزمایش با پایین‌ترین نتیجه منفی کاذب، 3 روز بعد از شروع علائم یعنی 8 روز پس از مواجهه با بیماری می‌باشد. وقتی که احتمال عفونت قبل از آزمایش افزایش پیدا کند، وجود عفونت بعد آزمایش هم افزایش پیدا می‌کند حتی اگر آزمایش منفی دریافت کنید. اگر بعد از مواجهه آزمایش بدهید، احتمال اینکه عفونت قبل از آزمایش با بعد از آزمایش برابر باشد وجود دارد و این نشانگر این است که انجام آزمایش بی‌فایده است.

از زمان شیوع بیماری کرونا، نگرانی‌ها از حساسیت پایین آزمایش RT-PCR بالا رفت و مطالعات جدید نشان داد که حساسیت این آزمایش 59% است. ما یک مدل قابل دسترس برای عموم طراحی کرده‌ایم که یک چارچوب مناسب برای تخمین انجام این آزمایشات از زمان مواجهه فراهم می‌نماید. این مدل به محض به دست آمدن اطلاعات بیشتر به روز رسانی خواهد شد. آزمایشات RT-PCR که برای شناسایی SARS-COV-2 انجام می‌شوند، چنانچه بلافاصله پس از مواجهه با عامل عفونی انجام شوند ارزش تشخیصی پایینی خواهند داشت. علت این موضوع، وجود یک پنجره‌ی زمانی بین آلوده شدن با ویروس و قابل شناسایی شدن آن توسط RT-PCR می‌باشد که در دیگر عفونت‌های ویروسی نظیر HIV و‌ هپاتیت C نیز دیده می‌شود (۲۰ و ۲۱).

طبق مطالعه به دست آمده، این پنجره زمانی 3-5 روز است. ولی در زمان دریافت منفی آزمایش در دوره پنجره‌ای نیز باید محدودیت ارتباط با دیگران و قرنطینه رعایت شود. نتیجه منفی پس از 7 روز به حداقل می‌رسد ولی 21% هم احتمال دریافت منفی کاذب وجود دارد. روش‌های نمونه گیری و تنوع فردی در میزان منتشر کردن ویروس از جمله مکانیسم‌های احتمالی دریافت نتایج منفی کاذب به شمار می‌رود. یکی از موارد مورد بحث این است که آیا آزمایشات سریالی در مقایسه با یک آزمایش منفرد مزیتی دارند یا خیر. به فرض مستقل بودن نتایج، آزمایشات سریالی قطعا باعث کاهش میزان نتایج منفی کاذب خواهند شد؛ با این حال تا زمانی که علت زمینه‌ای بالا بودن نتایج منفی کاذب مشخص نشده باشد، این ادعا قابل دفاع نخواهد بود.

مثلا: اگر تنوع فردی در منتشر کردن ویروس، یکی از علل افزایش نتایج منفی کاذب باشد، انجام آزمایش‌های محتلف در مقابل آزمایش منفرد فایده‌ای ندارد.اگر چه ما از مطالعات کوچک مقیاس (No large-scale studies) مطلع هستیم، برخی گزارشات اولیه حاکی از عدم مستقل بودن نتایج می‌باشند؛ به‌عنوان مثال یک گزارش موردی نشان می‌دهد در یک فرد، که عفونت وی با یافته‌های رادیولوژیک و RT-PCR انجام شده بر روی نمونه‌ی تهیه شده از ترشحات نای مسجل شده بود، نتیجه‌ی RT-PCR انجام شده بر روی نمونه‌های تهیه شده از حلق بینی در دوره‌ی بالینی بیماری منفی بودند(۶).

در کل می‌توان گفت که باید مطالعات بیشتری به منظور تعیین علت ضعف عملیاتی آزمایش RT-PCR در شناسایی عفونت SARS-COV-2 انجام شوند. رابطه اندازه عفونتی بودن (Infectiousness) و نتیجه منفی کاذب هنوز مشخص نیست و افرادی که نتیجه آزمایش حلق و بینی منفی دریافت کردند، احتمال کمتری در انتقال بیماری به دیگران نقش دارند. ولی با بالا رفتن نتایج کاذب پس از روز نهم، مشخص شد که این نتایج واقعا منفی نبودند ولی به عنوان عدم وجود عفونت را نشان می‌داد. با این حال متوجه میشویم که شرح سیر بالینی آینده و نتیجه آزمایش به هدفی که آزمایش داشت بستگی دارد. به طور مثال زمانی که انجام آزمایش برای خروج فرد مبتلا از قرنطینه باشد، دریافت نتیجه منفی کاذب درست است.

از این رو برای شناسایی چگونگی افزایش ویروس، باید مطالعات بیشتری انجام شود. ولی اگر هدف آزمایش تعیین نیاز یا عدم نیاز به پیگیری‌های بیشتر یا تصمیم گیری برای درمان یا عدم درمان فرد به‌عنوان یک فرد مبتلا به SARS-COV-2 با هدف کاهش تماس باشد، در این صورت آزمایش ممکن است نتواند اطلاعات مطلوب را در اختیار ما قرار بدهد و لذا نیاز است تا هر گونه اقدامی با رعایت احتیاط انجام شود. در سیر عفونت آنتی بادی‌ها نیز به وجو می‌آیند که در نتیجه امکان ترکیبی از آزمایش آنتی‌بادی و RT-PCR از بیشترین کارایی در بررسی افراد بدون علامت یا افرادی که مواجهه‌ی نامشخصی داشته‌اند‌، برخوردار باشد.

این مطالعات محدودیت‌هایی نیز به همراه دارد. ناهمگونی چشمگیری در مطالعات زمینه‌ای، که تحلیل ما بر اساس اطلاعات حاصل از آن‌ها انجام گرفت، وجود داشت. در این صورت، وقتی که ما اندازه حساسیت را مورد بررسی قرار دادیم و مطالعات را نوبتی حذف کرده و دانستیم که هیچ کدام از مطالعات اثر گذاری ویژه ای ندارد و نتیجه‌های به دست آمده بدون تغییر است. راه‌های جمع‌آوری نمونه در این مطالعات متفاوت بوده و در بعضی از مطالعات هم بدون اشاره بیشتر به جزئیات، بیان می‌کند که نمونه‌های تهیه شده از مجاری تنفسی فوقانی می‌باشند. از این رو، ما توانایی حساب به روی انواع روش‌های  جمع‌آوری نمونه را نداریم.

بسیاری از مطالعات، نمونه‌ها را در زمان آغاز علایم (نه در زمان مواجهه) مورد بررسی قرار داده بودند که این موضوع باعث تنوع زیاد در تخمین‌های انجام شده در روزهای اول پس از مواجهه می‌شد. مدل ما فقط برای یک بار مواجهه‌ی شناخته شده قابل استفاده است و برای مواجهه‌ی مکرر، نظیر مواجهه‌ی روزانه‌ی کارکنان مراکز بهداشتی با بیماران شناخته شده‌ی SARS-COV-2، مناسب نمی‌باشد. زمان شرح و تفسیر نتایج آزمایش برای تشخیص و شناسایی عفونت، حتما باید احتیاط کرد. به خصوص وقتی که نتایج به دست آمده به‌عنوان مبنایی برای لغو محدودیت‌های اعمال شده (که هدف آن‌ها کاهش انتشار بیماری بوده است) قلمداد می‌شوند تا به منفی کاذب نرسد.

در آخر بیشتر مطالعات، موارد مثبت حقیقی را به صورت مثبت بودن حداقل یک آزمایش RT-PCR تعریف کرده بودند، به این نتیجه دست مییابیم افرادی که هرگز آزمایش آن‌ها مثبت نشده، بیمار محسوب نمی‌شوند. این موضوع می‌تواند باعث شود که نرخ منفی کاذب حقیقی (True false-negative) کمتر از حد واقعی خود حساب شود.

بر اساس دو مطالعه که به روی افرادی که به بیماری مشکوک و ویژگی اپیدمیولوژیک بودند انجام شد، مشخص شد که اصلا آزمایش‌های سرولوژی آنها مثبت نشد. پس درمی‌یابیم که طبقه بندی نامناسب در بیماران وجود داشته که در این بخش بعضی از آزماش‌های منفی کاذب واقعا منفی هستند. ما معتقدیم که اثر این عامل مخدوش کننده بسیار کم است چرا که با حذف این مطالعات از تحلیل انجام شده، استنتاج اولیه تغییری نکرد. به طور خلاصه می‌توان گفت که در هنگام تفسیر نتایج آزمایش RT-PCR برای شناسایی عفونت SARS-COV-2 باید با احتیاط عمل کرد، به‌ویژه زمانی که این نتایج به‌عنوان مبنایی برای برداشتن محدودیت‌های اعمال شده (که هدف آن‌ها کاهش انتشار بیماری بوده است) قلمداد می‌شوند.

زمانی که شک بالینی افزایش پیدا کند، حتی با منفی بودن نتیجه آزمایش هم نباید احتمال عفونی بودن فرد را رد کرد. حتما باید اپیدمیولوژی و شرایط بالینی هم مورد بررسی قرار گرفته و به آن توجه شود. در بسیاری از اوقات، زمانی که فرد با بیماری مواجه شده مشخص نیست، در این هنگام آزمایش بر اساس شروع علائم در نظر گرفته می‌شود. در روز 18 بعد از مواجهه یعنی روز سومی که علائم آغاز شده بهترین زمان برای انجام تست است که نتیجه منفی کاذب به حداقل خود می‌رسد. پزشکان برای انجام آزمایش، باید ۱ تا ۳ روز پس از آغاز علایم صبر کنند تا نتیجه‌ی منفی کاذب را به حداقل برسانند. به منظور تعیین ویژگی‌های این آزمایش و شناسایی روش‌هایی با حساسیت بیشتر، نیاز است تا مطالعات بیشتری انجام شوند.

پرسشنامه اضطراب کرونا در اعتباریابی مقدماتی از اعتبار و روایی مطلوبی برخوردار است و می توان از آن به عنوان یک ابزار علمی و معتبر برای سنجش اضطراب کرونا ویروس استفاده نمود.